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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| D8416-1μg | pU6-gRNA | 1μg | 888.00元 |
| D8416-100μg | pU6-gRNA | 100μg | 1169.00元 |
碧云天生产的pU6-gRNA，是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术而研发的用于构建表达特定guide RNA (gRNA)的哺乳动物表达质粒的载体质粒。用户仅需按照使用说明设计并合成靶基因特异性的寡核苷酸(Target-specific DNA oligos)，然后经过退火形成双链后，按照使用说明进行操作，即可构建成用于CRISPR基因编辑的特异性sgRNA的完整表达质粒。质粒构建成功后与Cas9表达质粒或dCas9 (dead Cas9)转录激活或转录抑制表达质粒共转染哺乳动物细胞后，可以通过Zeocin抗性基因进行gRNA表达阳性细胞的筛选，阳性细胞中通常就会出现预期的目的基因的基因编辑或基因表达调控。
CRISPR/Cas9是一项突破性的基因组编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的DNA核酸酶Cas9对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(Adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在gRNA引导下通过Cas9对原核和真核生物的基因组DNA的靶向序列进行位点特异性的切割，然后通过易错修复(Error-prone repair)或同源重组(Homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过基因编辑而实现基因敲除。其中gRNA确保识别位点的特异性。随着CRISPR技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等[1, 2]。
CRISPR/Cas9系统由Cas9 Nuclease和gRNA复合物所组成。gRNA，也称sgRNA (Single guide RNA)，由18-20bp与靶基因序列互补的CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与Cas9特异性结合的Trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。gRNA通过与靶序列之间的互补配对，将Cas9 Nuclease引导至靶DNA，Cas9 Nuclease C端的与PAM (Proto-spacer adjacent motif)相互作用的结构域(PAM-interacting domain)识别富含G碱基(5'-NGG-3')的PAM序列，在HNH和RuvC两个结构域的协同作用下，在PAM序列NGG上游大约三个碱基处产生DNA的双链断裂(Double-strand break, DSB)。如果该双链DNA断裂发生在细胞内，在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变(图1) [1]。
将Cas9 Nuclease的HNH和RuvC两个结构域进行突变，即可得到无核酸酶活性的dCas9。dCas9虽不能切割DNA，但仍可与sgRNA结合，并在sgRNA引导下特异性识别并结合至靶DNA。利用dCas9直接融合表达或间接招募转录调控因子，即可实现对sgRNA靶向基因的转录激活或转录抑制；而将dCas9与表观遗传修饰因子融合表达，则可对sgRNA靶向基因进行表观遗传修饰，如甲基化/去甲基化或乙酰化/去乙酰化等，从而实现对目的基因的表达调控[3]。
图1. CRISPR/Cas9基因编辑示意图。
碧云天同时提供可用于CRISPR-Cas9基因编辑的Cas9系列慢病毒、稳转细胞株及基因编辑相关检测试剂盒，为用户进行快速基因编辑提供全面解决方案。如需获取相应产品请在碧云天网站查询或在本产品网页点击相关产品。
碧云天还提供基于CRISPR-dCas9的可用于基因表达调控如转录调控及表观遗传修饰的质粒体系，用户可根据研究需要自行选购。利用本载体质粒构建靶向目的基因的sgRNA表达质粒，与上述dCas9相关表达调控质粒共转染，即可实现对靶基因的精准表达调控。具体请在碧云天网站查询或在本产品网页点及相关产品。
pU6-gRNA载体质粒中含有双BsaI IIS型限制性内切酶识别位点，方便用户借助Golden Gate Assembly进行sgRNA质粒的快速构建。
pU6-gRNA质粒为卡那霉素抗性。
pU6-gRNA质粒图谱如下。
图2. pU6-gRNA (D8416)质粒图谱。
碧云天pU6-gRNA的重组克隆效果如图3所示。
图3. 碧云天pU6-gRNA (D8416)的重组克隆实测效果图。按照本质粒使用说明进行操作，在1-2小时内即可完成sgRNA质粒的重组构建，且无需额外的载体酶切及凝胶回收步骤。实际检测效果会因实验条件的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
pU6-gRNA质粒的全序列信息请参考碧云天的网站上该质粒的信息。
pU6-gRNA质粒可使用的测序引物序列如下：
hU6-F Primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D8416-1µg | pU6-gRNA | 1µg |
| D8416-100µg | pU6-gRNA | 100µg |
| — | 说明书 | 1份 |
-20ºC保存，两年有效。
注意事项：100µg包装的本产品质粒浓度为0.5µg/µl，共200µl。
对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。
普通连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65ºC孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(Band shift)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
图4. DNA序列示例。
b. 单链DNA oligos的设计，请参考图5。
图5. 单链DNA oligo示例。
2. 合成双链oligo。| Reagent | Volume |
| sgRNA oligo forward (100μM) | 1µl |
| sgRNA oligo reverse (100μM) | 1µl |
| Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251) | 2µl |
| Ultrapure Water | 6µl |
| Total volume | 10µl |
| Step | Temperature | Time | Note |
| 1 | 95ºC | 5min | 让oligo充分变性 |
| 2 | -0.1ºC/sec, to 25ºC | About 15min | 退火 |
| 3 | 4ºC | Hold | 暂时存放 |
| Reagent | Volume |
| pU6-gRNA | 100ng |
| BsaI | 1µl |
| 10X Ligation Buffer | 2µl |
| T4 DNA Ligase | 1µl |
| Diluted annealed oligos (50nM) | 2µl |
| Ultrapure Water | To 20µl |
| Temperature | Time |
| 37ºC | 1h |
| 55ºC | 5min |
| 4ºC | ∞ |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| C0526 | Lipo6000™转染试剂 | 0.5/1.5/5×1.5ml |
| C0533 | Lipo8000™转染试剂 | 0.5/1.5/5×1.5ml |
| D0251 | Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) | 1ml |
| D0508 | 基因组编辑突变检测试剂盒 | 25/100次 |
| D0510 | FnCas12a (Cpf1) | 100/500/2000pmol |
| D0511 | Cas9 Nuclease (SpCas9) | 50/250/1000pmol |
| D1031 | DH5α超级感受态细胞 | 20×100/100×100µl |
| D5649-50μl | BeyoFast™ BsaI | 50µl |
| D7006 | T4 DNA Ligase | 40,000U |
| D7008 | T4 DNA Ligase | 200,000U |
| D7080 | T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) | 250/1250/5000U |
| D7168 | BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) | 20/100/500次 |
| D7170 | BeyoRT™ II cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser) | 20/100/500次 |
| D7178 | BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 | 20/100/500次 |
| D7180 | BeyoRT™ III cDNA合成试剂盒(with gDNA EZeraser) | 20/100/500次 |
| D7182 | BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) | 20/100/500次 |
| D7185 | BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X) (with gDNA EZeraser) | 20/100/500次 |
| D7260 | BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X) | 1/5/25ml |
| D7262 | BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX) | 1/5/25ml |
| D7265 | BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, High ROX) | 1/5/25ml |
| D7268 | BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit | 100/500次 |
| D7271 | BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X) | 1/5/25ml |
| D7272 | BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, Low ROX) | 1/5/25ml |
| D7273 | BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, High ROX) | 1/5/25ml |
| D7277 | BeyoFast™ Probe One-Step qRT-PCR Kit | 100/500次 |
| D7280 | 菌落直接PCR试剂盒 | 100/400/2000次 |
| D8403S | BeyoCRISPR™ Surrogate GFP Reporter构建试剂盒 | 10次 |
| D8407 | BeyoCRISPR™ sgRNA筛选试剂盒(替身报告基因法) | 5µg/each |
| D8414 | pCMV-RFP-STOP-GFP (Surrogate Reporter) | 1/100µg |
| D8416 | pU6-gRNA | 1/100µg |
| P0013B | RIPA裂解液(强) | 100ml |
| R0011 | Beyozol (总RNA抽提试剂) | 100ml |
| R0016 | Trizol (总RNA抽提试剂) | 100ml |
| ST102 | Kanamycin (10mg/ml, 1000X) | 5ml |
| ST1450-20mg | Zeocin (博莱霉素) | 20mg |
| ST1450-100mg | Zeocin (博莱霉素) | 100mg |
| ST1450-0.25ml | Zeocin (博莱霉素) | 20mg/ml×0.25ml |
| ST1450-1ml | Zeocin (博莱霉素) | 20mg/ml×1ml |
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