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产品编号: S0580S
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S0580S 多巴胺检测试剂盒(荧光法) 100次 498.00元

碧云天的多巴胺检测试剂盒(荧光法),即Dopamine Assay Kit (Fluorometric),又称多巴胺荧光检测试剂盒(Dopamine Fluorometric Assay Kit)或DA Assay Kit,是一种基于荧光法,快速、高灵敏地检测血清或血浆等生物体液、细胞培养上清以及细胞或组织裂解液、药物等样品中多巴胺含量的试剂盒。

多巴胺(Dopamine, DA/DP),也称儿茶酚乙胺、羟酪胺或2-(3,4-二羟基苯基)乙胺,是内源性含氮有机化合物,为酪氨酸(芳香族氨基酸)在代谢过程中经二羟苯丙氨酸所产生的中间产物。多巴胺是一种存在于神经组织和体液中的儿茶酚胺类神经递质,是脑功能的重要物质基础。它在人脑中特定区域的含量和分布影响着垂体内分泌机能的协调,与神经活动直接相关,还具有兴奋心脏、增加肾血流量的功能,因而可用于治疗缺血性、心源性及感染性休克,在运动和认知中起着关键作用。脑内多巴胺神经功能失调是精神分裂症和帕金森氏症的重要原因[1-3]。因此,多巴胺浓度的检测在神经生理机能、疾病诊断及相关药物的质量控制等方面有着重要意义[4, 5]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。在氧气存在的条件下,多巴胺与探针(DA Probe)反应生成发出强烈蓝色荧光的荧光产物(Fluorescent Product),激发波长为417nm,发射波长为460nm,多巴胺的含量和荧光产物的荧光强度成正比,通过检测荧光产物的荧光强度来计算多巴胺的含量。

图1.碧云天多巴胺检测试剂盒(荧光法) (S0580)检测原理图。

本试剂盒检测特异性强,检测灵敏度高,线性范围宽,样品用量少。本试剂盒提供的DA Probe对多巴胺具有高度的选择性,检测几乎不受尿酸、抗坏血酸、氨基酸、糖类、尿素、肾上腺素和去甲肾上腺素等的影响。在样品体积为20μl时,可以检测浓度低至0.01μM的多巴胺,在0.01-100μM (0.2-2000pmol或30.6pg-306ng)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了多巴胺标准溶液,可以通过绘制标准曲线(图2),计算出样品中的多巴胺含量。

图2.碧云天多巴胺检测试剂盒(荧光法) (S0580)检测多巴胺标准品的标准曲线。20μl经超纯水稀释的不同浓度的多巴胺标准品,与30μl DA Probe和50μl DA Assay Buffer混匀后,25ºC避光反应30分钟,激发波长417nm,发射波长460nm,测定荧光强度。在0.01-100μM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品,也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测,通用性强;而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液、细胞培养上清以及细胞或组织裂解液,以及含有盐酸多巴胺的药物制剂等样品的检测,全程约40分钟即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测,也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。对于多巴胺的检测通常使用ELISA法,灵敏性更高,但步骤相对繁琐、耗时长、成本高。对于多巴胺含量在本试剂盒检测范围内的情况,本试剂盒更快速、更方便、通量更高。

按照使用说明操作,用于96孔板检测时,本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0580S-1 BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay 25ml
S0580S-2 DA Assay Buffer 6ml
S0580S-3 DA Probe 3ml
S0580S-4 DA Standard (1mM) 100μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中DA Probe和DA Standard (1mM)须避光保存。

注意事项:

DA Assay Buffer和DA Standard (1mM)需要完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。DA Probe使用时应置于冰上,使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存,在首次使用解冻后建议适当分装后-20ºC避光保存。

本试剂盒中体积较小的试剂使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底,适当混匀后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板,推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存,保存的时间不得超过2周,否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20ºC保存,-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品的准备。
a.血液样品的准备:对于血清样品,将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时,不要剧烈摇晃以免溶血,待全血自然凝固并析出血清后,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色上清即得血清,注意不要吸取白色或淡黄色沉淀;对于血浆样品,将全血用肝素或者EDTA进行抗凝,4ºC约1000-2000×g离心10分钟,取黄色或淡黄色上清即得血浆,注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上,如果不能立即检测,也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品,在检测前解冻后冰浴存放备用,使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备:对于培养的贴壁细胞,PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞,先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内,弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液,适当吹打,冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。对于组织样品,按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液,使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟,取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测,可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备:对于贴壁细胞,直接取培养液;对于悬浮细胞,离心取培养液。
2.试剂盒的准备。
融解DA Assay Buffer和DA Standard (1mM),平衡至室温后混匀备用。DA Probe融解后放置于冰浴备用,使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
3.样品测定。
a.多巴胺标准曲线设置:取10μl DA Standard (1mM),加入90μl超纯水,混匀,配制成浓度为100μM的DA标准溶液。分别取100μM的DA标准溶液0、0.2、0.4、1、2、4、10、20μl加入96孔板的标准品孔中,并相应地用超纯水补足至20μl,此时,标准曲线的浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100μM。
注:荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。如果样品中多巴胺的浓度低于1μM,需设置浓度更低的标准曲线。
b.取1-20μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔样品背景对照孔中,并相应地加入超纯水补足至20μl
注1:为确保样品数值在标准曲线范围内,建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数,以确定样品中多巴胺的大致浓度,如果数值不在标准曲线范围内,请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释,加入的“稀释后的样品”为5µl,则n=10×20/5=40)。
注2:对于血清、组织裂解液上清等复杂样品,建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验,在适当的稀释倍数时,样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果,选取适宜的稀释倍数用于后续的测定,否则即使信号值在标准曲线的线性范围内,也可能无法得到理想的检测结果。
注3:组织样品中含有的多巴胺-β-羟化酶等可能会分解多巴胺,进而对检测结果造成一定的影响,在必要的情况下,可以将样品在95ºC孵育10分钟,以灭活样品中的多巴胺-β-羟化酶等,然后再取样品进行多巴胺的含量检测。
注4:样品的稀释请用超纯水,请勿使用DA Assay Buffer。
c.标准品孔和样品孔各孔加入30μl DA Probe样品背景对照孔加入30μl DA Assay Buffer,混匀。
d.各孔(包括标准品孔、样品孔及样品背景对照孔)加入50μl DA Assay Buffer,混匀,25ºC避光反应30分钟
e.反应结束后,设置激发波长为417nm,发射波长为460nm进行荧光强度检测。
f.建立标准曲线,并计算样品中多巴胺的浓度(A)。多巴胺标准曲线可以参考图2,在0.01-100μM浓度范围内有良好的线性关系。多巴胺浓度的计算公式如下:
C (μM)=A×n
注:A为步骤3f根据标准曲线确定的多巴胺含量(μM);
n为步骤3b样品总稀释倍数。
可根据多巴胺的分子量153.18计算出样品中多巴胺的质量浓度(ng/ml)=C×153.18。
参考文献:
1.Lin X, Zhang Y, Chen W, Wu P. Sens and Actuator. B Chem. 2007. 122(1) 309-314.
2.Hyman SE, Malenka RC. Nat Rev Neurosci. 2001. 2(10):695-703.
3.Heien ML, Khan AS, Ariansen JL, Cheer JF, Phillips PE, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. 102(29):10023-8.
4.Ali SR, Ma Y, Parajuli RR, Balogun Y, Lai WY, et al. Anal Chem. 2007. 79(6):2583-7.
5.Ankireddy SR, Kim J. Int J Nanomedicine. 2015. 10 Spec Iss(Spec Iss):113-9.
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