使用说明：
1. BeyoNectin™用于提高病毒感染细胞的效率。
(1) BeyoNectin™提高病毒感染细胞效率的使用方法建议。
BeyoNectin™提高病毒感染细胞效率的使用方法有2种：BeyoNectin™-bound virus (BBV)法和Supernatant infection (SNI)法。
a. BBV法：是指先将病毒溶液加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中，病毒先与BeyoNectin™特异性结合，通过洗涤去除未结合的组分，然后再加入靶细胞进行病毒感染(图5A)。
b. SNI法：是指将病毒溶液与靶细胞直接混合后，加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中(图5B)。
注1：未经纯化的病毒，推荐使用BBV法，因为未经纯化的病毒溶液中可能含有降低病毒感染细胞效率的物质。
注2：如果是浓缩后的病毒，推荐使用BBV法；如果浓缩后的病毒需要稀释4倍以上使用，则BBV法和SNI法促病毒感染效率相同，但SNI法更简单，耗时也更少。

图5. 碧云天BeyoNectin™ Recombinant Human Fibronectin Fragment (C0352)使用方法流程图。

(2) BeyoNectin™包被未表面处理的细胞培养容器(Non-treated tissue cell culture vessel)。
a. 准备BeyoNectin™工作液。BeyoNectin™工作液的推荐浓度为20-100μg/ml (对应于孔板的有效面积约4-20μg/cm²)，不同细胞培养容器的用量可参考下表。推荐使用PBS (pH7.4, Low Endotoxin, Cell Culture Grade) (C0221B)对BeyoNectin™进行稀释。

Non-treated tissue cell culture vessel	Actual area (cm2)	Coat/Block/Wash volume (ml)	BeyoNectin™ (μg)
96-well plate	~0.32	0.1	2-10
48-well plate	~1.1	0.2	4-20
24-well plate	~1.9	0.5	10-50
12-well plate	~3.5	1	20-100
6-well plate	~9.6	2	40-200
35mm dish	~8.8	2	40-200
60mm dish	~21.5	5	100-500
100mm dish	~56.7	10	200-1000
150mm dish	~145	15	300-1500
T-25 flask	~25	3	60-300
T-75 flask	~75	8	160-800
T-175 flask	~175	15	300-1500

注1：此步骤需要无菌操作，推荐在生物安全柜或超净工作台中进行。
注2：BeyoNectin™的工作液浓度和用量可根据具体实验自行优化。
b. BeyoNectin™包被细胞培养容器。将适当体积的BeyoNectin™工作液加入到表面未处理的细胞培养容器中，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。推荐碧云天的96孔板(平底, 带盖) (FPT010/FPT011)、6厘米或9厘米培养皿(无菌) (FDSH106/FDSH109)。
c. 封闭。去除上清，将合适体积的封闭液(2% BSA Fraction V in PBS)加入细胞培养容器中，室温孵育30分钟，去除上清。
注：封闭液需要预先过滤除菌，推荐使用BeyoGold™针头滤器(0.22μm/33mm, PES, Sterile) (FF362)。
d. 洗涤。将合适体积的PBS加入细胞培养容器中，清洗一次，去除上清。
注：如果不立刻使用，可以用BeyoGold™封板膜(透明, 自粘型, PP) (FSF030)或Parafilm封口膜(4英寸×125英尺) (FPF566)封闭细胞培养容器，置于4ºC保存，一周有效。不能置于-20ºC保存。
(3) 准备病毒工作液。
用细胞培养液将病毒稀释到合适浓度，不同细胞培养容器需要病毒工作液的体积(Virus volume)、细胞接种密度(Seeding density)可参考下表。

BeyoNectin™-treated cell culture vessel	Seeding density (cells)	Virus volume (ml)	Wash volume (ml)
96-well plate	1.6-8×103	0.05	0.1
48-well plate	0.55-2.75×104	0.1	0.2
24-well plate	0.95-4.75×104	0.25	0.5
12-well plate	1.75-8.75×104	0.5	1
6-well plate	4.8-24×104	1	2
35mm dish	4.4-22×104	1	2
60mm dish	1.1-5.3×105	2.5	5
100mm dish	2.8-14.1×105	5	10
150mm dish	7.2-×105	7.5	15
T-25 flask	7×105	1.5	3
T-75 flask	2.1×105	4	8
T-175 flask	4.9×105	7.5	15

注1：如果病毒滴度较高，可用细胞培养液稀释到合适浓度。
注2：具体接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素而确定。最佳接种数量通常为培养2-3天后细胞汇合度达到90-100%。
(4) BeyoNectin™-bound virus (BBV)法。
BBV法根据病毒结合BeyoNectin™的过程中是否离心，分为BBV不离心法和BBV离心法。BBV离心法能够有效促进病毒与BeyoNectin™结合，因此BBV离心法比BBV不离心法感染细胞的效率更高，建议采用BBV离心法。
a. BBV离心法(二选一，更推荐使用)。
(a) 将合适体积的病毒工作液加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中。
(b) 离心。离心机预热到32ºC，1,000-2,000×g离心2小时。
(c) 洗涤。去除上清，立刻加入合适体积的PBS清洗一次。
注：不要使细胞培养容器内表面干涸。
b. BBV不离心法(二选一)。
(a) 将合适体积的病毒工作液加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中。
(b) 孵育。32或37ºC细胞培养箱孵育4-6小时。
(c) 洗涤。去除上清，立刻加入合适体积的PBS清洗一次。
注：不要使细胞培养容器内表面干涸。
c. 病毒感染靶细胞。
在步骤(4) a (b)或(4) b (b)进行中准备待病毒感染的靶细胞，使用处于指数增长期、状态良好的靶细胞对病毒感染效率至关重要。造血干细胞可能需要提前使用细胞因子进行刺激，细胞因子的类型和用量请根据实验需要使用。
(a) 收集细胞，对细胞进行计数，根据不同细胞培养容器将靶细胞稀释到合适浓度。
注：具体的细胞接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素确定。最佳接种数量通常为培养2-3天后细胞汇集度达到90%-100%。
(b) 步骤(4) a (c)或(4) b (c)，去除上清后，立刻将合适体积的靶细胞加入到含有病毒的细胞培养容器中。
注：不要使细胞培养容器内表面干涸。
(c) 离心机预热到32ºC，1,000-2,000×g离心1小时。
(d) 37ºC，5% CO₂细胞培养箱孵育2-3天后，根据实验需要进行下一步操作。
(5) Supernatant infection (SNI)法。
使用处于指数增长期、状态良好的靶细胞对病毒感染效率至关重要。造血干细胞可能需要提前使用细胞因子进行刺激，细胞因子的类型和用量请根据实验需要使用。
a. 收集细胞，对细胞进行计数，根据不同细胞培养容器将靶细胞稀释到合适浓度。
注：具体的细胞接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素确定。最佳接种数量通常为培养2-3天后细胞汇集度达到90%-100%。
b. 靶细胞，1,000-2,000×g离心5分钟，去除上清。
c. 合适体积的病毒工作液重悬靶细胞，加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中。
d. 离心机预热到32ºC，1,000-2,000×g离心1小时。
e. 37ºC，5% CO₂细胞培养箱孵育2-3天后，根据实验需要进行下一步操作。
2. BeyoNectin™促进细胞贴壁。
a. 按照步骤1 (2)准备BeyoNectin™包被的细胞培养容器。
b. 用合适的培养液将细胞稀释到合适浓度，加入到BeyoNectin™包被的细胞培养容器中。
c. 离心机预热到32ºC，1,000-2,000×g离心5分钟。
d. 37ºC，5% CO₂细胞培养箱孵育2-3天后，根据实验需要进行下一步操作。
3. BeyoNectin™与CD3抗体联用增强体外T细胞的激活和扩增。
a. 准备BeyoNectin™和CD3抗体工作液。BeyoNectin™和CD3抗体工作液的推荐浓度为20-100μg/ml(对应于孔板的有效面积约4-20μg/cm²)，不同细胞培养容器的用量可参考下表。推荐使用PBS (pH7.4, Low Endotoxin, Cell Culture Grade) (C0221B)对BeyoNectin™和CD3抗体进行稀释。

Non-treated tissue cell culture vessel	Actual area (cm2)	Coat/Block/Wash volume (ml)	BeyoNectin™ (μg)	Anti-CD3 Antibody (μg)
96-well plate	~0.32	0.1	2-10	2-10
48-well plate	~1.1	0.2	4-20	4-20
24-well plate	~1.9	0.5	10-50	10-50
12-well plate	~3.5	1	20-100	20-100
6-well plate	~9.6	2	40-200	40-200
35mm dish	~8.8	2	40-200	40-200
60mm dish	~21.5	5	100-500	100-500
100mm dish	~56.7	10	200-1000	200-1000
150mm dish	~145	15	300-1500	300-1500
T-25 flask	~25	3	60-300	60-300
T-75 flask	~75	8	160-800	160-800
T-175 flask	~175	15	300-1500	300-1500

注1：此步骤需要无菌操作，推荐在生物安全柜、细胞超净工作台中进行。
注2：BeyoNectin™和CD3抗体的工作液浓度和用量可根据具体实验自行优化。
b. BeyoNectin™和CD3抗体包被细胞培养容器。将合适体积的BeyoNectin™和CD3抗体工作液加入到表面未处理的细胞培养容器中，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。推荐碧云天的96孔板(平底, 带盖) (FPT010/FPT011)、6厘米或9厘米培养皿(无菌) (FDSH106/FDSH109)。
c. 封闭。去除上清，将合适体积的封闭液(2% BSA Fraction V in PBS)加入细胞培养容器中，室温孵育30分钟，去除上清。
注：封闭液需要过滤除菌，推荐使用BeyoGold™针头滤器(0.22μm/33mm, PES, Sterile) (FF362)。
d. 洗涤。将合适体积的PBS加入细胞培养容器中，清洗一次，去除上清。
注：如果不立刻使用，可以用BeyoGold™封板膜(透明, 自粘型, PP) (FSF030)或Parafilm封口膜(4英寸×125英尺) (FPF566)封闭细胞培养容器，置于4ºC保存，一周有效。不能置于-20ºC保存。
e. T细胞的激活和扩增。
(a) 用合适的培养液将T细胞稀释到合适浓度，加入到BeyoNectin™和CD3抗体包被的细胞培养容器中。
注：T细胞扩增需要加入的Recombinant human IL-2，具体用量可参考相关文献。
(b) 离心机预热到32ºC，1,000-2,000×g离心5分钟。
(c) 37ºC，5% CO₂细胞培养箱孵育2-3天后，根据实验需要进行下一步操作。
参考文献：
1. Kimizuka F, Taguchi Y, Ohdate Y, Kawase Y, Shimojo T, et al. J Biochem. 1991. 110(2):284-91.
2. Nasiri F, Muhammadnejad S, Rahbarizadeh F. Clin Exp Med. 2023. 23(6):2535-2549.
3. Stock S, Hoffmann JM, Schubert ML, Wang L, Wang S, et al. Hum Gene Ther. 2018. 29(10):1167-1182.
4. Hosoi H, Ikeda H, Imai N, Amaike C, Wang L, et al. Eur J Immunol. 2014. 44(6):1747-58.
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