碧云天生物技术-超热稳定单链结合蛋白(ET SSB)(D7026S)

试剂> 核酸相关> 反转录与PCR> 等温扩增

超热稳定单链结合蛋白(ET SSB)

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产品编号: D7026S

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产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
D7026S	超热稳定单链结合蛋白(ET SSB)	50μg	148.00元
D7026M	超热稳定单链结合蛋白(ET SSB)	200μg	468.00元

碧云天生产的超热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB），即Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种在95ºC孵育60分钟后仍保持完全活性的具有极高热稳定性的单链DNA结合蛋白。ET SSB能以聚合体的形式与单链DNA结合，保护单链DNA免受核酸酶降解或防止单链DNA重新配对形成二级结构，常用于核酸扩增及测序[1]。

ET SSB蛋白是一种不依赖于特异性序列的单链DNA结合蛋白，它不能结合RNA或双链DNA。ssDNA存在易被DNase降解、易形成二级结构等特点，其不稳定性极大限制了酶促反应的正常进行；ET SSB蛋白与ssDNA的结合可稳定并保护单链DNA免被DNase降解或形成二级结构，促使DNA聚合酶与底物结合，进而提高DNA聚合酶的催化活性，改善PCR等的扩增效率。

SSB蛋白存在于几乎所有种类的生物中，虽然所有的SSB蛋白都具有相似的功能，但它们的序列相似性很小、与ssDNA结合特性差异较大，根据其聚集状态，SSB蛋白可分为单体、同源二聚体、异源三聚体和同源四聚体四类。ET SSB蛋白源自极度嗜热微生物，在溶液中主要以单体形式存在，每个单体编码一个OB-fold结构域，只有在结合单链DNA底物时，才会形成二聚体或多聚体[3]。

ET SSB蛋白与E.coli SSB蛋白具有相似的单链DNA结合特性，但因存在单个与DNA结合的OB-fold结构域及一个灵活的C端尾部结构，具有更强的热稳定性[4]，在95ºC孵育60分钟后仍保持完全活性；而E.coli SSB蛋白则在高于65ºC时就失去大部分活性。

碧云天的ET SSB蛋白与E.coli SSB蛋白热稳定性比较请参考图1。

图1. 碧云天超热稳定单链结合蛋白(ET SSB) (D7026)与E.coli Single-Stranded DNA Binding Protein (SSB) (D7024) (E.coli SSB)的热稳定性对比图。在10µl反应体系中，加入10pmol ssDNA (56bp)及图中指定量的本产品或E.coli SSB蛋白(0-1µg)，随后用缓冲液(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, pH7.5 @ 25ºC)补齐至10μl，37ºC孵育15分钟，使充分结合。取10μl反应产物，加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)混匀，使用BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(6%, 15孔) (GS306)在100V条件下进行电泳检测。电泳结束后，在室温下使用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)对凝胶进行染色20-30分钟，紫外灯下拍照观察实验结果。如图所示，与E.coli SSB蛋白相比，ssDNA与ET SSB蛋白所生成的复合物并不会因热处理被破坏，说明本产品与ssDNA结合具有良好的热稳定性。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

用途：提高PCR和RT-PCR反应DNA聚合酶扩增效率；稳定单链DNA结构；促进RecA蛋白对单链DNA的结合活性和链置换能力。

碧云天ET SSB蛋白优化多重PCR反应的效果请参考图2。

图2. 碧云天超热稳定单链结合蛋白(ET SSB) (D7026)和国外N公司(Competitor)的同类产品优化多重PCR反应的活性检测效果图。在10µl反应体系中，加入1µl 10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg²⁺)、0.5U BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7221)、0.8µl dNTP Mixture (2.5mM each) (D7371)、0.1µl五对引物混合物(10µM each)、0.1ng模板、图中指定量的ET SSB (1-10ng)，随后用超纯水补齐至10μl。设置PCR反应程序：92ºC预变性3分钟，92ºC变性30秒，55ºC退火30秒，68ºC延伸30秒，共35个循环，68ºC最终延伸10分钟。反应结束后，加入2µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)混匀，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳结束后，紫外灯下拍照观察实验结果。如图所示，本产品与N公司产品相比，对DNA聚合酶的扩增反应有相似的促进作用。实际检测效果会因实验条件、样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

来源：通过E.coli重组、表达纯化而获得，表达基因来源于嗜热微生物。

分子量：16kDa。

纯度：经SDS-PAGE检测，纯度大于95%；且不含DNase、RNase和磷酸酯酶。

储存液：10mM Tris-HCl, 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol (pH7.4 @ 25ºC).

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7026S	超热稳定单链结合蛋白(ET SSB) (0.5μg/μl)	100µl
D7026M	超热稳定单链结合蛋白(ET SSB) (0.5μg/μl)	400µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，两年有效。

注意事项：

首次开管盖前，建议8,000-12,000×g离心约10秒，使附着在管盖或管壁上的液体聚集于管底。

ET SSB蛋白在大多数DNA聚合酶的PCR缓冲液中都具有活性，参考工作浓度为4ng/μl。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. ET SSB蛋白可广泛兼容各种PCR、DNA测序、限制性内切酶酶切等常见的分子生物学反应体系，为保护ssDNA不被DNase降解，推荐在反应体系中加入终浓度为4ng/μl的ET SSB。具体的一些用途可以参考如下的使用说明。
2. 单链DNA结合实验。
a. 在10μl反应体系(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, pH7.5 @ 25ºC)中加入适量的ssDNA及2μl (1µg)的ET SSB蛋白。
注1：建议最后添加ET SSB蛋白。
注2：请在冰浴上配制反应体系。
注3：ssDNA的用量可按照ET SSB蛋白与ssDNA的摩尔比为4:1左右进行调整和尝试。
注4：最佳ssDNA添加量的参考标准是：在固定ET SSB蛋白使用量不变的情况下，加入ssDNA进行结合反应后所形成的ET SSB 蛋白与ssDNA复合物的量最多，且不会出现过量的游离ssDNA时即为最佳使用量。
注5：ET SSB蛋白通常能兼容各种类型的反应缓冲液，可广泛适用于大多数常规的分子生物学反应体系。
b. 配制好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
c. 反应条件：37ºC孵育15分钟(注意保持恒温，否则会影响ssDNA与ET SSB蛋白的结合效率)。
注：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
d. 取适量反应后产物，按比例加入EMSA上样缓冲液，混合均匀。推荐使用碧云天生产的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色, 10X) (GS006)或EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)。
e. 将反应后产物进行EMSA PAGE凝胶电泳。推荐使用碧云天生产的BeyoGel™系列EMSA PAGE预制胶(GS301/GS302/GS305/GS306)或EMSA PAGE凝胶配制试剂盒(GS298)。
注：在正式电泳前，推荐在100V条件下，预电泳30分钟，随后上样并在冰上使用100V电压进行电泳，直至样品中的溴酚蓝电泳至凝胶的2/3位置处时，可停止电泳。
f. 使用碧云天的NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)对凝胶进行染色约20-30分钟后，即可在紫外灯下拍照观察，分析ET SSB蛋白与ssDNA的结合效果。
3. 多重PCR扩增实验。
a. ET SSB蛋白在DNA复制或修复过程中，能阻止解旋酶释放的单链DNA返回到双链DNA，增加DNA聚合酶的活性，最终促进DNA复制或修复。如需使用ET SSB蛋白改善多重PCR的扩增效果，可参考如下步骤进行。
b. 引物设计。
引物设计对于成功进行多重PCR至关重要，建议使用适当的引物设计软件进行引物设计：
(1)引物的长度通常为20-30个核苷酸；
(2)GC含量为40-60% (优选45-55%)；
(3)避免所用的多个引物的3'末端出现互补序列，避免引物3'末端有3个或更多的G/C，避免引物内的二级结构；
(4)在尽可能的情况下所用引物的Tm值不低于60ºC，推荐在Tm值在65-68ºC之间更佳，引物间的Tm值差异应控制在5-6ºC以内。此处提到Tm值按照Tm=2n(A)+2n(T)+4n(G)+4n(C)进行计算，例如一条引物含有3个A、7个T、4个G和6个C，那么Tm=2×3+2×7+4×4+4×6=60。
c. 引物配制。
每种合成的引物推荐配制为100µM，然后配制成每个引物的最终浓度为10µM的引物混合物。
d. 按照下表配制反应体系。

Reagent	Volume
Ultrapure Water	xµl
10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg²⁺)	1µl
dNTP (2.5mM each)	0.8µl
Template	yµl (0.1ng)
Primer mix (10µM each)	0.1µl
ET SSB (50ng/µl)	0.8µl (40ng)
BeyoFusion™ DNA Polymerase	0.2µl
Total Reaction Volume	10µl

注1：ET SSB (50ng/µl)可以使用自行配制的储存液：10mM Tris-HCl, 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol (pH7.4 @ 25ºC)、1X BeyoFusion™ Buffer (with Mg²⁺)或其它适当溶液把超热稳定单链结合蛋白(ET SSB) (0.5μg/μl)稀释10倍获得。
注2：Template及其所对应的Primer mix (10µM each)的使用量仅供参考，Template或Primer mix (10µM each)不同，ET SSB蛋白对PCR反应的促进效果也不同，可设置Template或Primer mix (10µM each)浓度梯度以确认最佳使用量。
e. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
f. 按照下表设置PCR反应程序。

PCR Process Steps	Cycles	Temperature	Time	Description
Step 1	-	92ºC	3min	Initial denaturation
Step 2	35	92ºC	30s	Denaturation
		55ºC	30s	Annealing
		68ºC	15s/kb	Extension
Step 3	-	68ºC	10min	Final extension
Step 4	-	4ºC	Forever	Hold

g. 向反应体系中加入2μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，然后使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
4. 其它用途请自行根据实验目的，查阅相关文献资料进行。
参考文献：
1. Shereda RD, Kozlov AG, Lohman TM, Cox MM, Keck JL. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2008. 43(5):289-318.
2. Olszewski M, Grot A, Wojciechowski M, Nowak M, Mickiewicz M, et al. BMC Microbiol. 2010. 10:260.
3. Morten MJ, Peregrina JR, Figueira-Gonzalez M, et al. Nucleic Acids Res. 2015. 43(22):10907-24.
4. Morten MJ, Gamsjaeger R, Cubeddu L, Kariawasam R, Peregrina J, et al. Extremophiles. 2017. 21(2):369-379.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
D7024	E.coli Single-Stranded DNA Binding Protein (SSB)	100µg/500µg/2mg
D7025	Recombinant E.coli RecA Protein	200µg/1mg
D7026	超热稳定单链结合蛋白(ET SSB)	50µg/200µg
P7415	Recombinant SSB	100µg/500µg
D7050	Bst DNA Polymerase, Large Fragment	800U/4000U
D7053	phi29 DNA Polymerase	250U/1kU/5kU/20kU
D7055	Bsu DNA Polymerase, Large Fragment	200U/1000U
D7057	T4 Gene 32 Protein (ssDNA结合蛋白)	100µg/500µg/2mg
D7220/D7221	BeyoFusion™ DNA Polymerase	200U/1000U
D7301	BeyoMulti™多重PCR试剂盒	100次/500次
D7303S	BeyoMulti™ PCR Enhancer (2X)	2ml
D7305	Easy-Load™ Multiplex PCR Master Mix (2X)	100次/500次
D7360	Uracil-DNA Glycosylase (E.coli)	1000U/5000U
D7362	Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium)	100U/500U
D7364	Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod)	200U/1000U/5000U
D7371	dNTP Mixture (2.5mM each)	1ml
D7373	dNTP Mixture (25mM each)	250μl