碧云天的人线粒体DNA拷贝数qPCR检测试剂盒(染料法)，即Human Mitochondrial DNA Copy Number qPCR Kit with SYBR Green，也称线粒体DNA拷贝数法人线粒体生物合成检测试剂盒(Human Mitochondrial Biogenesis Assay Kit by mtDNA Copy Number)、线粒体与细胞核DNA比例检测试剂盒(Human Mitochondrial to Nuclear DNA Ratio Kit)，是一种通过染料法qPCR (Quantitative PCR)扩增线粒体与核基因DNA，并快速、高效、灵敏地定量不同人样品的线粒体DNA相对于核基因组DNA拷贝数，从而用于评估线粒体生物合成、功能状态等的试剂盒。如果自行准备线粒体DNA标准品，也可以对于线粒体DNA进行绝对拷贝数检测。本产品为防污染型，含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

人线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)，是一种单倍体双链环状DNA，长度为16.5kb，编码37个基因。线粒体的分裂对于细胞的正常功能有重要作用。每个细胞中的线粒体数量因线粒体的分裂和融合而发生变化，通常较难对于线粒体数量直接进行定量，线粒体DNA拷贝数(Mitochondrial DNA copy number, mtDNA-CN)可以相对精确进行定量，并可以作为评价线粒体功能的生物标志物[1]。大量证据表明，mtDNA-CN的改变一方面和生理功能的变化有关，另一方面也和各种与年龄相关的疾病，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病等密切相关。与核基因组DNA不同的是，mtDNA以多拷贝(例如100-10000个)存在，具体数量取决于细胞类型[2]。定量PCR通常被认为是检测mtDNA-CN的金标准，通过将线粒体DNA的拷贝数与核DNA的拷贝数进行比较，以实现mtDNA-CN的相对定量[3]。如有必要也可以设置mtDNA的标准品，以进行绝对定量。

本试剂盒提供了qPCR实验所需预混液BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, UDG)和特异性引物，预混液包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分。本试剂盒提供了两对引物，一对是基于人线粒体基因组DNA设计的引物(mtDNA Primer Mix)；一对是基于人15号染色体上编码β2-微球蛋白(beta-2-microglobulin, B2M)的单拷贝基因(Single copy reference, SCR)而设计的核DNA引物(nDNA Primer Mix)，用于定量的均一化。每组引物均经过充分的筛选并验证，特异性高，通常不会出现非特异性扩增。

本试剂盒检测灵敏，扩增效率高，所用引物组检测2.5-40ng/μl范围内的基因组DNA样品时，扩增效率可达90-110%。不同浓度梯度的HeLa细胞基因组DNA分别使用mtDNA Primer Mix和nDNA Primer Mix扩增，并绘制标准曲线。结果显示两个标曲均呈现良好的线性关系，表明本试剂盒具有稳定的扩增效果，线粒体DNA拷贝数定量准确度高。使用本试剂盒分别使用mtDNA Primer Mix和nDNA Primer Mix的扩增曲线及标准曲线可参考图1。

图1. 碧云天人线粒体DNA拷贝数qPCR检测试剂盒(染料法) (D8036)分别使用mtDNA Primer Mix、nDNA Primer Mix对于不同浓度梯度的HeLa细胞基因组DNA的扩增曲线及标准曲线。NTC, No Template Control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择添加高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, UDG)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须避光保存，并尽量避免反复冻融。

使用前请务必确保试剂完全融化，充分混匀后使用。混匀过程尽量避免产生气泡。

BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, UDG)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应体系时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染型，但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

如需进行线粒体DNA的绝对定量检测，需自备人线粒体DNA标准品。人线粒体DNA标准品可以使用纯化的人线粒体提取。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。