使用说明：
1.样品的制备。
a.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每20-100万细胞加入100-200μl的比例加入Lysis Buffer，适当吹打。对于贴壁细胞适当吹打使细胞脱离培养器皿并转移至离心管中。对于组织样品，按照每10-20mg组织加入100-200μl的比例加入Lysis Buffer。对于培养的细胞和组织，推荐把体积控制在100-200μl使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆；也可以考虑把体积放大到400-500μl左右，采用瓷珠机械震荡的方式进行匀浆；或者也可以使用常规的玻璃匀浆器进行匀浆(建议尽量使用较小的玻璃匀浆器，以便于把样品的体积控制在较小体积范围内)。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后继检测。
b.收集离心后的上清液，测定蛋白浓度。推荐使用BCA法或Bradford法进行蛋白定量。根据蛋白浓度测定结果调整蛋白浓度，确保蛋白浓度在1-5mg/ml。如果蛋白浓度过低或者过高，可能会影响后续Western等检测结果的清晰度和可判读性。
c.样品保存。样品制备完成后，建议尽快进行后续实验步骤。如果样品需要保存，可将其分装至适当的体积后，存放于-80ºC冻存。长期存放时，应避免反复冻融，以防蛋白质降解。
2.Protease用量测试(选做)。
为确定适合实验体系的Protease用量，建议首先进行预实验，通过设置不同的Protease与总蛋白比例，观察不同浓度的Protease对蛋白稳定性的影响。在选择Protease的浓度时，以蛋白条带发生明显变化为标准，条带过浅或过深时均不易观察到蛋白稳定性的改变。因此需选择合适的Protease用量，以便正式实验时能更好地观察药物影响靶蛋白稳定性的变化，同时可参考相关文献中推荐的Protease与蛋白比例。
a.Protease (10μg/μl)的配制。2mg的Protease溶于200μl超纯水配制成10μg/μl的Protease，分装后于-20ºC保存，避免反复冻融，并于6个月内使用完毕。
b.根据设置的Protease与蛋白样品中总蛋白质的比例稀释Protease (10μg/μl)，制备所需浓度的Protease工作液。取10μl Protease (10μg/μl)加入240μl超纯水，即得0.4μg/μl的Protease，随后按照下表进行倍比稀释(以每组蛋白样品中加入2μl一定浓度的Protease工作液、总蛋白量为100μg为例)。也可以根据预实验和实验需要调整Protease与总蛋白的用量。

Vial Number	Volume of Ultrapure water	Volume of Protease	Concentration of Protease	Protease	Protease:Total Protein
A	240μl	10μl Protease (10μg/μl)	0.4μg/μl	0.8μg	1:125
B	125μl	125μl of Vial A	0.2μg/μl	0.4μg	1:250
C	125μl	125μl of Vial B	0.1μg/μl	0.2μg	1:500
D	125μl	125μl of Vial C	0.05μg/μl	0.1μg	1:1000
E	125μl	125μl of Vial D	0.025μg/μl	0.05μg	1:2000
F	125μl	125μl of Vial E	0.0125μg/μl	0.025μg	1:4000
G	125μl	125μl of Vial F	0.00625μg/μl	0.0125μg	1:8000
H	125μl	125μl of Vial G	0.003125μg/μl	0.00625μg	1:16000

注1：配制好的Protease溶液使用前置于冰上或4ºC，Vortex充分混匀后使用。
注2：每次稀释时应注意充分混匀。
c.每组蛋白样品加入2μl稀释好的Protease工作液并混匀，以便Protease充分接触并作用于目标蛋白。将混匀的样品瞬离后，40ºC孵育30分钟。推荐碧云天的BeyoFuge™掌上离心机(5000rpm) (E6686)、BeyoBath™干式恒温金属浴(1.5/2ml×40) (E6662)。
注：酶解前的蛋白样品应置于冰上或4ºC。
d.孵育结束后，立即加入相应比例的Protease Inhibitor Cocktail (100X)终止酶解反应，例如100μl的反应体系可以加入1μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)。此操作应迅速且准确，避免过度酶解影响实验结果。
e.根据样品体积加入相应比例的Loading Buffer (6X)，例如100μl的反应体系加入20μl的Loading Buffer (6X)。
f.95ºC加热10分钟，以充分变性蛋白质。
g.进行Western检测PDK2蛋白的酶解情况。检测结果请参考图4。
图4.碧云天药物亲和反应靶蛋白稳定性检测试剂盒(DARTS Assay Kit) (S3206)用于不同Protease与总蛋白比例筛选的检测效果图。每组100μl 100μg的A-431细胞总蛋白，加入2μl稀释好的Protease工作液。混匀，40ºC孵育30分钟进行蛋白消化。孵育结束后加入1μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)终止反应，并加入20μl Loading Buffer (6X)，混匀后95ºC加热10分钟。随后通过Western检测PDK2蛋白的酶解情况，一抗为PDK2/PDHK2 Rabbit Monoclonal Antibody (AG2846)。结果显示Protease和蛋白比例约为1:1000时，蛋白条带变化明显，便于后续实验观察小分子药物是否能影响蛋白的稳定性。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
3.药物处理。
a.药物工作液的配制。根据参考文献资料设置药物浓度梯度，稀释母液并制备所需浓度的药物工作液。例如，可制备0.05、0.1、0.5、1、5µM不同浓度的药物工作液。
注：每次实验须分别设置未加Protease的阴性对照(Negative Control)组和未加Protease和药物的空白对照(Blank Control)。推荐每管加入100μl 1mg/ml蛋白样品(总蛋白量为100μg)，蛋白浓度和体积须同步骤2b保持一致。
b.每管分别加入2μl不同浓度的药物工作液。空白对照组中加入2μl所用药物所对应的溶剂(如纯水、DMSO等)。轻轻混匀后，置于室温摇床孵育60分钟，或4ºC孵育过夜。孵育温度和时间可根据药物的性质及参考文献或相关经验调整。
4.酶解处理。
a.Protease (10μg/μl)的配制。2mg的Protease溶于200μl超纯水配制成10μg/μl的Protease，分装后于-20ºC保存，避免反复冻融，并于6个月内使用完毕。
b.根据步骤2确定的Protease与蛋白样品中总蛋白质的比例稀释母液，制备所需浓度的Protease工作液。稀释步骤应在冰上进行，以确保酶活性稳定。
c.向各实验组中加入2μl稀释好的Protease工作液，阴性对照组中使用相同体积的超纯水替代。
注：酶解前的蛋白样品应置于冰上或4ºC。
d.混匀后离心数秒以沉淀液体，40ºC孵育30分钟。推荐碧云天的BeyoFuge™掌上离心机(5000rpm) (E6686)、BeyoBath™干式恒温金属浴(1.5/2ml×40) (E6662)、BeyoBath™ DB100干式恒温金属浴(1.5/2ml×35) (E6663)。
e.孵育结束后，立即加入相应比例的Protease Inhibitor Cocktail (100X)终止酶解反应，例如100μl的反应体系加入1μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)。此操作应迅速且准确，避免过度酶解影响实验结果。
5.样品处理和保存。
通常可以通过Western检测，明确目的蛋白的对于蛋白酶稳定性的耐受是否因相应药物而发生改变，也可以通过LC-MS/MS检测特定药物对于未知的靶标蛋白稳定性的影响。如果靶标蛋白是一个已知的酶，并且有合适的酶活性检测方法，也可以通过适当的酶活性检测方法，进行高通量的药物筛选。靶标蛋白已知的情况下，也可以酌情采用ELISA等适当方法检测目的蛋白的稳定性。如下仅以Western检测和LC-MS/MS检测为例进行说明。
a.根据样品体积，加入相应比例的Loading Buffer (6X)，例如100μl的反应体系加入20μl的Loading Buffer (6X)。
b.95ºC加热10分钟，以充分变性蛋白。
c.处理后的样品可立即用于后续分析(如果是验证药物的已知靶点可以直接进行Western检测，如果是探索特定药物的未知靶点或全新靶点，可以采用LC-MS/MS等分析)。如需保存样品，应立即置于-80ºC冻存，以防止蛋白质降解。
注：详细的Western实验步骤可以参考碧云天的相关网页：http://www.beyotime.com/support/western.htm。
常见问题：
1.假阳性结果的出现与鉴别方法。
鉴别假阳性结果的方法：(1)可以设置多个不同的Protease浓度组，观察DARTS结果是否表现出剂量依赖性。(2)可以使用其它药物靶蛋白鉴定技术，如表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)、细胞热位移分析(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA)、蛋白质氧化速率稳定性(Stability of Proteins from Rates of Oxidation, SPROX)等，验证蛋白质是否与药物结合。
2.已知药物靶点蛋白DARTS结果为阴性原因分析。
当已知的药物靶点DARTS结果为阴性时，可能由以下几种原因导致。药物含量可能不足以产生效应，建议适当增加药物剂量、扩大药物剂量梯度进行重新检测；当DARTS技术通过凝胶染色可视化分析DARTS结果时，针对低丰度靶蛋白的鉴定需谨慎优化实验条件以提高其检测灵敏度。
参考文献：
1.Ren YS, Li HL, Piao XH, Yang ZY, Wang SM, et al. Biochem Pharmacol. 2021. 194:114798.
2.Lomenick B, Hao R, Jonai N, Chin RM, Aghajan M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. 106(51):21984-9.
3.Huang L, Wang D, Zhang C. Methods Mol Biol. 2021. 2213:175-182.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
S3206	药物亲和反应靶蛋白稳定性检测试剂盒(DARTS Assay Kit)	100次/500次
S3211S	平行人工膜血脑屏障通透性检测试剂盒(PAMPA-BBB)	96次
S3303S	上市药物库(2818个, 10mM×10μl)	36个96孔板